在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)快速發(fā)展的背景下，精準(zhǔn)高效的分子檢測技術(shù)成為作物遺傳改良與抗病育種的關(guān)鍵支撐。

全球糧食安全面臨著作物產(chǎn)量提升與生物脅迫防控的雙重挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)育種方法周期長、效率低，難以滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對優(yōu)良品種的迫切需求。分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為作物遺傳改良提供了新途徑，其中實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)因其高特異性、高靈敏度和準(zhǔn)確定量能力，已成為基因表達(dá)分析、分子標(biāo)記篩選和病原菌檢測的核心手段。

博清生物科技（南京）有限公司作為專注于生命科學(xué)儀器研發(fā)的企業(yè)，其熒光定量PCR儀在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢。該儀器融合了快速升降溫技術(shù)、多通道熒光檢測系統(tǒng)和便攜化設(shè)計(jì)，既滿足實(shí)驗(yàn)室高通量分析需求，又可實(shí)現(xiàn)田間現(xiàn)場檢測。

一、材料與方法

（一）儀器性能參數(shù)

本研究采用博清生物熒光定量PCR儀，其核心技術(shù)參數(shù)如下：樣本容量為8×0.2mL透明PCR管，支持20-100μL反應(yīng)體系；采用帕爾貼加熱制冷方式，溫度范圍4-100℃，溫度準(zhǔn)確性±0.1℃，均一性±0.15℃；配備4個高效單色LED光源和SiPMT檢測器，激發(fā)/發(fā)射波長范圍455-650nm/510-750nm，支持FAM/SYBR Green、VIC/HEX、ROX、Cy5等常用熒光染料；儀器重量僅1.4kg，可電池供電，適用于野外現(xiàn)場檢測。

（二）實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化

1、核酸提取與質(zhì)量控制

采用CTAB法提取作物葉片基因組DNA或總RNA，使用NanoDrop測定A260/A280比值（1.9-2.1）和濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證核酸完整性（28S/18S≥1.5）。RNA樣本經(jīng)DNaseⅠ處理去除基因組DNA污染，設(shè)置無逆轉(zhuǎn)錄對照（No-RT control）驗(yàn)證處理效果，要求Cq值≥35。

2、qPCR反應(yīng)體系配置

優(yōu)化后的20μL反應(yīng)體系包含：2×TaqMan混合液10μL，上、下游引物各0.5μL（終濃度0.2-0.5μmol/L），探針 0.4μL（終濃度 0.2μmol/L），模板 DNA/cDNA 1μL（20ng/μL），ddH?O補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，60℃退火延伸35s，40個循環(huán)，在退火延伸階段收集熒光信號。

3、數(shù)據(jù)分析方法

采用2^(-ΔΔCt) 法進(jìn)行基因相對表達(dá)量分析，以β-actin作為內(nèi)參基因。設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用儀器自帶軟件進(jìn)行熔解曲線分析，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，要求單一熔解峰且無引物二聚體干擾。

二、結(jié)果與分析

（一）在作物育種中的應(yīng)用

1、基因拷貝數(shù)變異分析

在芥菜葉形改良研究中，利用博清生物qPCR儀檢測BjRCO基因拷貝數(shù)變異。結(jié)果顯示，裂葉芥菜品種中BjRCO基因拷貝數(shù)顯著高于圓葉品種（P<0.01），與重測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性達(dá)到0.96，證實(shí)該方法準(zhǔn)確性。通過優(yōu)化Mg2?濃度（2.5mM）和退火溫度（60℃），檢測變異系數(shù)（CV）降至1.2%，較傳統(tǒng)PCR方法靈敏度提高10倍。

2、分子標(biāo)記輔助選擇

在大白菜高活力種子選育中，基于BraPYL分子標(biāo)記開發(fā)的qPCR檢測體系，可快速區(qū)分高活力種子（323bp單一條帶）。博清儀器的4通道檢測能力實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)片段與內(nèi)參基因的同步擴(kuò)增，檢測時間較瓊脂糖電泳法縮短6小時，且在種子萌發(fā)早期（24h）即可準(zhǔn)確預(yù)測活力水平。田間試驗(yàn)表明，該方法篩選的高活力種子出苗率提高23%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)芽試驗(yàn)。

（二）在抗病研究中的應(yīng)用

1、抗病基因表達(dá)動態(tài)監(jiān)測

在水稻紋枯病抗性研究中，采用博清qPCR儀分析接種后24h和48h免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，抗病品種"月亮谷"中WARK71和WARK53基因表達(dá)量分別上調(diào)8.3倍和6.7倍，顯著高于感病品種（P<0.05），且兩個時間點(diǎn)的表達(dá)差異通過高分辨率熔解曲線得到有效區(qū)分。儀器的快速升降溫功能（6℃/s）使每個反應(yīng)循環(huán)時間縮短至45s，全天可完成96個樣本的8重基因檢測。

2、病原菌多重檢測體系

針對煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY），建立基于博清qPCR儀的三重檢測方法。優(yōu)化后的體系檢測下限分別達(dá)到2.60×101、1.25×101和2.33×101copies/μL，批內(nèi)與批間CV均<1.5%。田間樣本檢測顯示，該方法與單重PCR結(jié)果一致性達(dá)100%，但檢測效率提升3倍，且通過便攜設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了田間采樣后3小時內(nèi)獲得檢測結(jié)果。

三、討論

博清生物qPCR儀在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中的技術(shù)優(yōu)勢主要體現(xiàn)在三個方面：其一，高靈敏度檢測能力（低至10copies/μL）使其能夠準(zhǔn)確量化作物基因組中的低豐度變異和病原菌早期侵染信號，這對于抗病基因的精細(xì)定位至關(guān)重要；其二，多通道熒光檢測系統(tǒng)支持多重反應(yīng)同時進(jìn)行，顯著降低了育種篩選成本，如在三重病毒檢測中試劑消耗量減少60%；其三，便攜化設(shè)計(jì)突破了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測的時空限制，特別適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)的田間快速診斷。

與同類產(chǎn)品相比，博清儀器的溫度均一性（±0.15℃）確保了檢測數(shù)據(jù)的高重復(fù)性，這在基因表達(dá)譜分析中尤為重要。其獨(dú)特的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)無需頻繁校準(zhǔn)，長期使用穩(wěn)定性優(yōu)于同類進(jìn)口產(chǎn)品，年度維護(hù)成本降低約30%。在實(shí)際應(yīng)用中，該儀器成功實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室基因分型到田間抗病性驗(yàn)證的全鏈條技術(shù)支持，將傳統(tǒng)育種中的表型選擇周期從generations 縮短至分子水平的數(shù)月。

本研究也存在一定局限性：首先，部分作物特異性標(biāo)記的qPCR體系仍需進(jìn)一步優(yōu)化；其次，儀器的高通量檢測能力在大規(guī)模育種群體篩選中略顯不足。未來可通過開發(fā)384孔板模塊和自動化樣本處理系統(tǒng)加以改進(jìn)。此外，結(jié)合數(shù)字PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)絕對定量，將進(jìn)一步提升檢測精度，特別是在基因編輯作物的拷貝數(shù)驗(yàn)證中具有應(yīng)用潛力。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀通過整合高靈敏度檢測、多通道分析和便攜化設(shè)計(jì)三大核心技術(shù)，為作物育種與抗病研究提供了一體化解決方案。在作物遺傳改良中，該技術(shù)顯著提升了基因拷貝數(shù)變異檢測和分子標(biāo)記篩選的效率；在抗病研究中，實(shí)現(xiàn)了抗病基因表達(dá)動態(tài)監(jiān)測和病原菌快速鑒定的精準(zhǔn)化。實(shí)踐證明，博清生物qPCR技術(shù)能夠有效縮短育種周期、提高抗病品種培育效率，對推動農(nóng)業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新和精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要實(shí)踐意義。未來通過與基因組編輯、大數(shù)據(jù)分析等技術(shù)的深度融合，有望在作物分子設(shè)計(jì)育種中發(fā)揮更大作用。