厭氧發酵技術是生物制藥領域的核心工藝之一，廣泛應用于抗生素（如頭孢菌素前體）、益生菌制劑（如雙歧桿菌疫苗）、功能性小分子（如短鏈脂肪酸）等產品的研發與生產。其核心需求在于構建嚴格厭氧、參數穩定的微環境——若O?殘留量＞0.1%，會導致厭氧菌株呼吸鏈阻斷；溫度波動±1℃以上，將抑制菌體酶活；CO?濃度失衡則會破壞培養基pH緩沖體系，最終導致產物合成效率下降30%以上。

傳統普通厭氧培養箱存在三大局限：一是依賴氮氣置換實現厭氧，O?殘留量難以穩定控制在0.05%以下；二是溫度控制精度僅±0.5℃，且腔體內溫度分布不均；三是缺乏CO?實時調控模塊，無法匹配菌株代謝對氣體配比的動態需求。博清生物科技（南京）有限公司研發的三氣培養箱針對上述痛點設計，集成了“真空-氮氣置換-氧氣催化”三級厭氧系統、PID智能控溫模塊及混合氣體精準配比單元，但其在厭氧發酵生物制藥中的具體應用效果尚未有系統研究。

本研究以產SCFAs的梭狀芽孢桿菌為模式菌株，通過對比實驗驗證該設備對菌體生長、產物合成及發酵穩定性的調控作用，為其在生物制藥科研及中試階段的應用提供數據支撐。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、菌株：梭狀芽孢桿菌，購自美國典型培養物保藏中心，用于生產SCFAs。

2、培養基：庖肉培養基，121℃高壓滅菌20min后冷卻至室溫。

3、核心設備：博清生物三氣培養箱；普通厭氧培養箱；高效液相色譜儀；紫外分光光度計。

（二）實驗方法

1、發酵體系構建

菌株活化：將梭狀芽孢桿菌凍干粉接種至庖肉培養基，在博清生物三氣培養箱中預培養24h（37℃，O?≤0.05%，N? 100%），獲得對數期種子液。

發酵接種：將種子液按5%（v/v）接種量接入500mL三角瓶（裝液量200mL），分別置于博清生物三氣培養箱（實驗組）與普通厭氧培養箱（對照組）中，設定發酵參數：溫度37℃，濕度80% RH，實驗組CO?/N?=5%/95%，對照組無CO?調控（僅N?平衡）。

2、參數監測與檢測

環境參數監測：每隔2h記錄兩組培養箱的腔體內溫度、O?濃度、CO?濃度，計算24h內參數波動范圍。

菌體生長檢測：每隔4h取樣，用紫外分光光度計測OD???值，繪制生長曲線；采用平板計數法計算菌落形成單位（CFU/mL）。

產物檢測：發酵72h后，取樣離心（8000r/min，10min），上清液經0.22μm濾膜過濾后，用HPLC檢測SCFAs濃度。

重復性驗證：兩組分別進行3次平行發酵實驗，計算菌體濃度、SCFAs產量的CV值。

二、結果與分析

（一）培養箱環境參數穩定性對比

博清生物三氣培養箱與普通厭氧培養箱的24h參數波動情況。實驗組溫度波動僅±0.08℃，O?濃度穩定在0.03%-0.05%，CO?濃度精準維持在5.0%±0.05%；對照組溫度波動達±0.45℃，O?濃度波動范圍0.12%-0.28%，且無CO?調控能力。這表明博清生物三氣培養箱的多參數協同控制精度顯著優于普通培養箱，可滿足厭氧發酵對微環境穩定性的嚴苛需求。

（二）菌體生長情況分析

實驗組菌體在12h進入對數期，28h達到穩定期，最大OD???值為2.86，CFU/mL為1.92×10?；對照組在18h才進入對數期，34h達到穩定期，最大OD???值為2.32，CFU/mL為1.56×10?。

關鍵原因分析：博清培養箱的低氧環境（O?≤0.05%）減少了菌體的氧化應激損傷，提前啟動對數期增殖；精準控溫避免了酶活波動，而CO?的穩定供給則維持了培養基pH在6.8-7.0的最佳范圍，進一步促進菌體代謝。

（三）SCFAs合成效率對比

發酵72h后，實驗組SCFAs總產量為16.8g/L（其中丁酸12.5g/L，乙酸4.3g/L），對照組總產量為14.2g/L（丁酸10.3g/L，乙酸3.9g/L），實驗組產量提升18.2%。這是因為SCFAs合成依賴于菌體的乙酰輔酶A代謝通路，博清培養箱的穩定微環境提高了關鍵酶（如丁酸激酶）的活性，同時減少了代謝中間產物的流失。

（四）發酵過程重復性驗證

3次平行實驗結果顯示，實驗組菌體濃度的CV值為2.8%，SCFAs產量的CV值為3.1%；對照組菌體濃度CV值為7.5%，SCFAs產量CV值為8.3%。博清生物三氣培養箱的低變異系數表明其可顯著提升厭氧發酵的重復性，這對生物制藥科研中“實驗結果可復現”及中試放大的“工藝穩定性”至關重要。

三、討論

本研究證實，博清生物三氣培養箱通過三大核心優勢提升厭氧發酵生物制藥效率：

（一）三級厭氧系統：采用“真空抽除-氮氣置換-鈀催化劑除氧”流程，將O?殘留量控制在0.05%以下，解決了普通培養箱“厭氧不徹底”導致的菌體活性低問題；

（二）PID智能控溫：通過腔體內多點溫度傳感器實時反饋，控溫精度達±0.1℃，避免了溫度波動對酶活的抑制，縮短菌體延遲期；

（三）動態氣體配比：可根據菌株代謝需求靈活調整CO?/N?比例，本研究中5% CO?的設定恰好匹配梭狀芽孢桿菌的pH緩沖需求，減少了培養基酸堿調節帶來的污染風險。

與現有研究對比，使用某品牌三氣培養箱雖能將SCFAs產量提升12%，但O?控制精度僅±0.08%，而博清生物三氣培養箱的O?精度達±0.03%，進一步降低了氧化損傷；同時，該設備集成的觸摸屏與數據記錄功能（可導出溫度、氣體濃度的實時曲線），為生物制藥科研的“工藝追溯”提供了便利。

本研究的局限性在于僅針對梭狀芽孢桿菌展開，未來可擴展至雙歧桿菌、產甲烷菌等其他厭氧制藥菌株，進一步驗證設備的通用性；同時可結合響應面法，優化不同菌株對應的最佳氣體配比與溫度參數，形成“菌株-設備參數”匹配數據庫。

博清生物科技（南京）有限公司研發的三氣培養箱可通過精準控制溫度、厭氧度及氣體配比，為厭氧發酵生物制藥構建穩定的微環境。在梭狀芽孢桿菌產SCFAs的實驗中，該設備使菌體對數期提前6h，最大菌體濃度提升23.5%，SCFAs產量提高18.2%，且發酵重復性（CV值3.1%）顯著優于普通厭氧培養箱。

博清生物科技（南京）有限公司研發的三氣培養箱可作為厭氧發酵生物制藥科研、中試階段的核心設備，為提升發酵效率、保障工藝穩定性提供關鍵技術支撐，具有廣闊的應用前景。