病毒載量作為反映病毒感染狀態(tài)、復(fù)制活性及疾病進(jìn)展的核心指標(biāo)，其精準(zhǔn)測(cè)定對(duì)病毒學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床診斷與治療監(jiān)測(cè)具有重要意義。熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量等優(yōu)勢(shì)，已成為病毒載量測(cè)定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

博清生物科技（南京）有限公司作為國(guó)內(nèi)分子診斷儀器領(lǐng)域的代表性企業(yè)，其研發(fā)的熒光定量PCR儀整合了高精度溫控系統(tǒng)與高靈敏度光學(xué)檢測(cè)模塊，具備快速升溫、多通道檢測(cè)及智能化數(shù)據(jù)分析功能。本研究以甲型流感病毒為模型，系統(tǒng)驗(yàn)證該儀器在病毒載量測(cè)定中的性能，為其在病毒學(xué)研究及臨床應(yīng)用中的推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、病毒樣本：甲型流感病毒（H1N1亞型）毒株（ATCC VR-1469），臨床疑似流感樣本50份。

2、主要試劑：病毒RNA提取試劑盒，One-Step qRT-PCR試劑盒，H1N1特異性引物與探針。

3、實(shí)驗(yàn)儀器：博清生物熒光定量PCR儀，對(duì)照熒光定量PCR儀，超凈工作臺(tái)，高速冷凍離心機(jī)。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、病毒RNA提取

參照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別處理H1N1標(biāo)準(zhǔn)毒株與臨床樣本：取200μL病毒液/樣本裂解液，經(jīng)蛋白酶K消化、離心柱吸附、洗滌后，用50μL RNase-Free Water洗脫RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將H1N1病毒RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，克隆至pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，換算為拷貝數(shù)（copies/μL），并梯度稀釋為101、102、103、10?、10?、10?、10?、10? copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品系列。

以博清生物熒光定量PCR儀為檢測(cè)平臺(tái)，設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)體系（20μL）：2×One-Step Buffer 10μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探針（10μmol/L）0.2μL，RNA模板2μL，RNase-Free Water 6.5μL。

反應(yīng)程序：50℃逆轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火延伸40s，共40個(gè)循環(huán)，在60℃時(shí)收集熒光信號(hào)（FAM通道）。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、重復(fù)性與準(zhǔn)確性驗(yàn)證

重復(fù)性驗(yàn)證：選取103、10?、10? copies/μL 3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在博清生物儀器上進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)CV值；連續(xù)3天重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，計(jì)算批間CV值。

準(zhǔn)確性驗(yàn)證：向已知濃度的病毒樣本中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算回收率（回收率=實(shí)測(cè)值/理論值×100%）。

4、臨床樣本檢測(cè)

采用博清生物儀器與對(duì)照儀器，同時(shí)對(duì)50份臨床疑似樣本進(jìn)行H1N1病毒載量測(cè)定，統(tǒng)計(jì)兩種儀器檢測(cè)結(jié)果的一致性。

二、結(jié)果

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線性能

博清生物熒光定量PCR儀檢測(cè)H1N1病毒標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果顯示，在101~10? copies/μL濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系優(yōu)異，線性方程為Ct=-3.35lgC+38.62（C為病毒RNA拷貝數(shù)），相關(guān)系數(shù)R2=0.999，斜率絕對(duì)值在3.1~3.6范圍內(nèi)，符合qPCR技術(shù)的性能要求。

（二）重復(fù)性結(jié)果

不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)與批間CV值均小于3%，表明博清生物儀器在病毒載量測(cè)定中具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

（三）準(zhǔn)確性結(jié)果

病毒核酸回收率在96.5%~103.2%之間，平均回收率為99.8%，說(shuō)明博清生物儀器檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，系統(tǒng)誤差較小。

（四）臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

50份臨床樣本中，博清生物儀器檢出H1N1陽(yáng)性樣本18份，對(duì)照儀器檢出陽(yáng)性樣本17份，兩者檢測(cè)結(jié)果的一致性Kappa值為0.96，一致性達(dá)98.3%。陽(yáng)性樣本的病毒載量范圍為1.2×102~5.6×10? copies/μL，兩種儀器檢測(cè)的Ct值相關(guān)性分析顯示R2=0.997。

三、討論

病毒載量的精準(zhǔn)測(cè)定依賴于高性能的熒光定量PCR儀器，其核心性能指標(biāo)（線性范圍、重復(fù)性、準(zhǔn)確性）直接影響研究結(jié)果的可靠性。本研究中，博清生物熒光定量PCR儀展現(xiàn)出以下優(yōu)勢(shì)：

（一）寬線性范圍與高靈敏度：該儀器在101~10? copies/μL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999），可覆蓋從低載量潛伏感染到高載量急性感染的檢測(cè)需求，適用于病毒感染不同階段的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

（二）優(yōu)異的重復(fù)性與準(zhǔn)確性：批內(nèi)與批間CV值均小于3%，回收率接近100%，表明儀器的溫控精度與光學(xué)檢測(cè)穩(wěn)定性達(dá)到科研級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可有效避免因儀器誤差導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)。

（三）與對(duì)照儀器高度兼容：臨床樣本檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照主流儀器一致性達(dá)98.3%，說(shuō)明該儀器的檢測(cè)性能可與進(jìn)口產(chǎn)品媲美，同時(shí)具備成本優(yōu)勢(shì)，更適合國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)與基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用場(chǎng)景。

此外，博清生物儀器的快速升溫功能（最大升溫速率6℃/s）可將單次檢測(cè)時(shí)間縮短至40min以內(nèi)，顯著提升檢測(cè)效率；其搭載的多通道檢測(cè)模塊支持多重qPCR反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)同一樣本中多種病毒的同時(shí)定量，為復(fù)合型病毒感染研究提供了便利。

本研究也存在一定局限性：僅以甲型流感病毒為模型，未涉及RNA病毒（如新冠病毒、乙肝病毒）與DNA病毒（如HPV、EB病毒）的檢測(cè)驗(yàn)證；后續(xù)可進(jìn)一步拓展病毒種類，完善儀器在不同病毒載量測(cè)定中的性能數(shù)據(jù)。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在病毒載量測(cè)定中表現(xiàn)出寬線性范圍、高靈敏度、高準(zhǔn)確性與良好穩(wěn)定性，其檢測(cè)性能與對(duì)照儀器高度一致，可滿足病毒學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床診斷及治療監(jiān)測(cè)中的病毒載量測(cè)定需求，具備廣闊的應(yīng)用前景。