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缺血性腦損傷是由腦血管阻塞導致腦組織缺氧、缺血引發的神經功能障礙，具有高發病率、高致殘率的特點，其病理機制及治療靶點研究依賴穩定的體外模型。體外細胞模型構建的核心在于精準模擬體內缺血微環境，其中缺氧（低氧濃度）和酸堿平衡（CO?濃度調控）的穩定維持是關鍵因素。

傳統普通培養箱僅能調控CO?濃度和溫度，無法實現低氧環境的精準、持續控制，導致缺血模型穩定性差、實驗重復性低，制約了研究進展。博清生物科技（南京）有限公司研發的三氣培養箱可同時精準調控O?、CO?和N?濃度，結合高精度控溫系統，能模擬不同缺血程度的微環境，為缺血性腦損傷細胞模型的標準化構建提供可能。本研究以大鼠皮層神經元為研究對象，系統評估博清生物三氣培養箱在缺血性腦損傷模型構建中的應用效果，為神經科學研究提供實驗支撐。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、細胞：新生SD大鼠皮層神經元（分離自出生24h內大鼠）；

2、儀器：博清生物三氣培養箱、普通CO?培養箱、倒置顯微鏡、酶標儀、電泳系統、免疫熒光顯微鏡；

3、試劑：神經元專用培養基、胎牛血清、CCK-8試劑盒、LDH釋放檢測試劑盒、Annexin V - FITC/PI凋亡檢測試劑盒、Caspase-3抗體、β-actin 抗體、二抗等。

（二）實驗分組

1、正常對照組：神經元在常規培養環境（21% O?、5% CO?、37℃）中培養；

2、缺血模型組（博清生物三氣培養箱組）：神經元在模擬缺血環境（1% O?、5% CO?、94% N?、37℃）中培養；

3、對照組（普通培養箱組）：嘗試通過密封培養瓶減少氧氣接觸模擬缺血，其余條件同正常對照組。

（三）實驗方法

1、大鼠皮層神經元分離與培養

新生SD大鼠消毒后取大腦皮層，剝離腦膜，剪碎組織后用胰蛋白酶消化，終止消化后吹打制成單細胞懸液，經篩網過濾后接種于包被多聚賴氨酸的培養板中，加入神經元專用培養基，置于常規培養環境中培養3d后更換培養基，培養7d用于后續實驗。

2、缺血性腦損傷模型構建

神經元培養至第7天，缺血模型組轉移至博清生物三氣培養箱中，設置參數為1% O?、5% CO?、37℃，持續培養6h構建缺血損傷模型；對照組在普通培養箱中，將培養瓶密封后培養6h；正常對照組繼續常規培養6h。

3、指標檢測

細胞活力檢測：采用CCK-8法，模型構建后向各孔加入CCK-8試劑，孵育2h后用酶標儀檢測450nm處吸光度值，計算細胞活力；

細胞損傷檢測：采用 LDH 釋放法，收集培養上清液，按照試劑盒說明書操作，檢測490nm處吸光度值，評估細胞膜損傷程度；

細胞凋亡檢測：采用Annexin V-FITC/PI雙染法，收集細胞后加入染色液孵育15min，流式細胞儀檢測凋亡率；

蛋白表達檢測：采用Western blot法，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，加入Caspase-3和β-actin一抗孵育過夜，二抗孵育后顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

（四）統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，數據以“平均值±標準差”表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

二、結果

（一）細胞活力變化

正常對照組細胞活力為（98.6±2.3）%；缺血模型組（博清生物三氣培養箱組）細胞活力顯著下降至（42.3±3.5）%；對照組（普通培養箱組）細胞活力為（78.5±4.2）%。缺血模型組細胞活力顯著低于正常對照組和對照組（P<0.05），且組內數據差異較小（變異系數<5%），對照組數據波動較大（變異系數>10%）。

（二）細胞膜損傷程度

正常對照組LDH釋放率為（12.5±1.8）%；缺血模型組LDH釋放率顯著升高至（68.7±4.1）%；對照組LDH釋放率為（35.2±5.3）%。缺血模型組LDH釋放率顯著高于其他兩組（P<0.05），且結果穩定性優于對照組。

（三）細胞凋亡率變化

正常對照組細胞凋亡率為（3.2±0.8）%；缺血模型組凋亡率顯著升高至（45.6±3.2）%；對照組凋亡率為（18.9±4.5）%。缺血模型組凋亡率顯著高于正常對照組和對照組（P<0.05），且實驗重復性良好。

（四）Caspase-3蛋白表達

與正常對照組相比，缺血模型組Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高（P<0.05）；對照組Caspase-3蛋白表達雖有升高，但幅度顯著低于缺血模型組，且組間差異較大。

三、討論

缺血性腦損傷的核心病理環節是缺氧引發的神經元損傷與凋亡，體外模型需精準復現這一核心特征。本研究中，博清生物科技（南京）有限公司研發的三氣培養箱通過精準調控O?濃度至1%，成功模擬了腦缺血后的缺氧微環境，誘導神經元出現明顯的活力下降、細胞膜損傷及凋亡增加，且Caspase-3蛋白表達顯著升高，這些變化與體內缺血性腦損傷的病理特征高度一致。

相比之下，普通培養箱通過密封方式模擬缺血，無法精準控制氧濃度，導致模型組細胞損傷程度較輕且結果波動較大，難以滿足科研實驗對穩定性和重復性的要求。博清生物三氣培養箱的優勢體現在三個方面：一是氧濃度調控精度高（0.1%~21%），可根據實驗需求設置不同低氧梯度，適配不同缺血程度的模型構建；二是三氣（O?、CO?、N?）協同調控，維持細胞培養環境的酸堿平衡和滲透壓穩定，減少非特異性損傷；三是控溫精度達±0.1℃，避免溫度波動對細胞狀態的影響，進一步提升實驗重復性。

本研究證實，博清生物科技（南京）有限公司研發的三氣培養箱構建的缺血性腦損傷細胞模型更貼近體內病理狀態，且具有良好的穩定性和重復性，可為缺血性腦損傷的分子機制研究、藥物篩選及療效評估提供可靠的實驗平臺。后續研究可利用該儀器探索不同缺血時間、不同氧濃度對神經元損傷的影響，進一步優化模型構建方案。

博清生物科技（南京）有限公司研發的三氣培養箱通過精準調控低氧環境，成功構建了穩定、可靠的缺血性腦損傷神經元模型，其誘導的細胞損傷和凋亡特征更貼近體內病理狀態，顯著優于傳統普通培養箱的模擬方法。該儀器為神經科學領域中缺血性腦損傷的體外研究提供了高質量的實驗工具，具有重要的科研應用價值。