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生物技術產業的快速發展推動了診斷試劑向精準化、快速化、便攜化方向升級，其中核酸診斷試劑因直接靶向病原體或疾病相關基因，成為感染性疾病診斷、遺傳病篩查、腫瘤早篩等領域的核心產品。熒光定量PCR技術作為核酸檢測的“金標準”，其檢測性能直接決定診斷試劑的靈敏度、特異性及臨床適用性，而PCR儀的硬件性能是技術落地的關鍵支撐。

目前，國內診斷試劑開發領域對高性能、高性價比的國產熒光定量PCR儀需求迫切。博清生物科技（南京）有限公司針對診斷試劑開發的核心痛點，研發了兼具精準性與實用性的熒光定量PCR儀，在光學設計、溫控精度、軟件適配性等方面進行專項優化。

一、材料與方法

（一）實驗儀器

博清生物熒光定量PCR儀，配備多通道光學檢測系統，溫控范圍4℃~100℃，升溫速率6℃/s，降溫速率6℃/s；進口儀器為某品牌熒光定量PCR儀。

（二）實驗材料

1、靶標核酸：新冠病毒（S基因）、甲型流感病毒（HA基因）、大腸桿菌（uidA基因）重組質粒標準品（濃度梯度101~10?copies/μL）。

2、試劑耗材：PCR反應預混液（含Taq酶、dNTPs、熒光染料）、特異性引物探針（由生工生物合成）、無酶純水、臨床模擬樣本（滅活病毒液、細菌培養液、健康人血清）。

（三）實驗設計

1、反應體系優化

以新冠病毒S基因為靶標，采用博清生物PCR儀，設置引物濃度（0.2~0.5μmol/L）、探針濃度（0.1~0.3μmol/L）、退火溫度（55~65℃）三因素三水平正交實驗，以Ct值、擴增效率（E）為評價指標，篩選最優反應體系。

2、特異性驗證

選取新冠病毒、甲型流感病毒、大腸桿菌及人類管家基因（GAPDH）核酸樣本，使用優化后的反應體系進行擴增，驗證儀器對特異性引物探針的識別能力。

3、靈敏度與線性范圍檢測

采用101~10?copies/μL的質粒標準品，進行3次重復檢測，繪制標準曲線，計算線性相關系數（R2）、擴增效率，確定儀器的檢測下限（LOD）。

4、重復性評估

對103、10?、10?copies/μL三個濃度的標準品，分別進行批內（n=8）和批間（n=3，連續3天）檢測，計算Ct值的變異系數（CV）。

5、臨床樣本適配性驗證

使用優化后的診斷試劑配方，對50份臨床模擬樣本（含25份陽性樣本、25份陰性樣本）進行檢測，對比博清生物PCR儀與進口儀器的檢測一致性。

二、結果與分析

（一）反應體系優化結果

正交實驗顯示，當引物濃度0.3μmol/L、探針濃度0.2μmol/L、退火溫度60℃時，擴增效果最佳。此時Ct值平均為22.3±0.5，擴增效率E=98.7%，符合診斷試劑開發的效率要求（90%~110%）。博清生物PCR儀的精準溫控能力的體現，可快速鎖定最優退火溫度，縮短體系優化周期。

（二）特異性驗證結果

僅靶標核酸樣本出現特異性擴增曲線，非靶標樣本及空白對照均無擴增信號，交叉反應率為0。表明該儀器的光學檢測系統可有效區分特異性熒光信號與背景噪音，保障診斷試劑的特異性。

（三）靈敏度與線性范圍

標準曲線分析顯示，在101~10?copies/μL濃度范圍內，R2=0.999，擴增效率E=99.2%。檢測下限（LOD）為101copies/μL，與進口儀器檢測結果一致，滿足臨床診斷試劑對低濃度樣本的檢出需求。

（四）重復性表現

批內檢測CV值為1.2%~2.5%，批間檢測CV值為1.8%~2.8%，均低于3%的行業標準。說明博清生物PCR儀的溫控穩定性和光學檢測一致性良好，可保障診斷試劑批間差異控制在合理范圍。

（五）臨床樣本適配性

50份臨床模擬樣本檢測中，博清生物PCR儀與進口儀器的陽性檢出率均為100%，陰性符合率100%，一致性kappa值=1.0。表明該儀器可適配臨床樣本基質，滿足診斷試劑臨床驗證階段的檢測需求。

三、討論

診斷試劑開發的核心訴求是兼顧性能可靠性與開發效率，而PCR儀的硬件性能直接影響試劑配方優化、性能驗證的周期與效果。博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀在本次實驗中展現出三大核心優勢：

首先，精準的溫控系統與多通道光學設計，保障了反應體系優化的高效性和特異性驗證的準確性。其快速升降溫能力可將單次擴增周期縮短至40分鐘內，相比傳統儀器提升30%效率，顯著加快試劑開發進程。

其次，寬線性范圍與高靈敏度，可覆蓋從低濃度病原體檢測到高濃度樣本定量的全場景需求，適用于感染性疾病早期診斷、療效監測等不同用途的試劑開發。

最后，良好的兼容性與重復性，使其可適配市面上主流的PCR預混液、引物探針，且批間差異小，為診斷試劑的產業化生產提供了穩定的檢測平臺。

與進口儀器相比，博清生物熒光定量PCR儀在核心性能指標上已實現持平，且在軟件操作的本土化適配、售后響應速度等方面更具優勢，可降低國內診斷試劑企業的開發成本與技術門檻。

博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀憑借精準的溫控性能、高靈敏度的光學檢測系統及良好的兼容性，可高效適配診斷試劑開發的全流程，包括反應體系優化、特異性驗證、靈敏度標定及臨床樣本驗證。其核心性能達到行業先進水平，能為生物技術產業中核酸診斷試劑的快速開發與產業化提供可靠技術支撐，助力國產診斷試劑的自主創新與市場推廣。未來可進一步拓展儀器在數字PCR、多重檢測等高端應用場景的適配性，滿足更復雜的診斷試劑開發需求。