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全球化背景下，新發突發傳染病頻發對公共衛生應急體系提出嚴峻挑戰，流行病學溯源作為疫情防控的核心環節，需快速明確病原體基因型特征、傳播鏈及變異趨勢，為精準防控提供科學依據。熒光定量PCR技術因具備高靈敏度、特異性及實時檢測優勢，已成為病原體檢測與溯源的核心技術平臺。博清生物科技（南京）有限公司自主研發的熒光定量PCR儀系列產品，整合多重熒光檢測、精準溫控等關鍵技術，適配不同應用場景需求。

一、材料與方法

（一）實驗儀器與試劑

1、核心儀器：博清生物熒光定量PCR儀，配套熒光定量分析軟件；

2、試劑：病毒/細菌核酸提取試劑盒、多重熒光定量PCR試劑盒；

3、標準品與對照：BRV、BCoV、K99標準菌株（ATCC編號分別為VR-99、VR-808、ATCC 25944），人蒼白桿菌標準菌株（CMCC 45234），陰性對照為無酶純水。

（二）實驗樣本

1、臨床樣本：126份牧區發熱患者血液樣本、89份腹瀉患者糞便樣本（來源于某三級醫院傳染病科）；

2、環境樣本：60份農貿市場環境涂抹樣本、45份飲用水樣本；

3、溯源驗證樣本：某地區聚集性疫情相關的32份密切接觸者咽拭子樣本。

（三）實驗方法

1、核酸提取

采用博清生物核酸提取試劑盒，按照說明書操作提取樣本核酸，熒光計定量（1-20μL 樣本體積），確保核酸濃度≥5ng/μL，純度A260/A280為1.8-2.0。

2、多重熒光定量PCR體系建立

基于目標病原體基因序列（GenBank數據庫下載），設計特異性引物與探針（DNAstar V7.1 軟件），優化反應體系：2×PCR Mix10μL，引物混合物（10μmol/L）2μL，探針混合物（5μmol/L）1μL，模板核酸2μL，補水至20μL。反應條件：預變性95℃ 3min；95℃ 10s，退火溫度58-62℃（梯度優化）30s，40個循環，六通道同時采集熒光信號。

3、方法學驗證

靈敏度：對10倍梯度稀釋的標準品進行檢測，記錄最低檢出濃度；

特異性：交叉檢測其他常見病原體（如沙門氏菌、甲型流感病毒等），驗證無交叉反應；

重復性：對同一批樣本進行3次重復檢測，計算Ct值變異系數（CV）。

4、流行病學溯源分析

結合樣本采集時間、空間分布及Ct值數據，通過MEGA 5.1軟件構建系統發育樹，分析病原體基因型特征，追溯傳播鏈；利用儀器配套軟件進行病毒載量動態監測，評估傳播風險。

二、結果

（一）儀器性能驗證

博清生物熒光定量PCR儀在六通道檢測模式下，各通道熒光信號無交叉干擾（CV<1.2%）；精準溫控系統使孔間溫度差≤±0.3℃，循環閾值（Ct）重復性良好（CV<2.0%）。8孔/16孔型號在現場檢測中，單批次樣本檢測時間≤90min，適配移動實驗室應急需求。

（二）檢測靈敏度與特異性

建立的三重熒光定量PCR體系對BRV、BCoV、K99的最低檢測限分別為3.8fg/μL、4.2fg/μL、5.1fg/μL，人蒼白桿菌最低檢測限達3.67fg/μL（Ct=36.40）；與15種非目標病原體無交叉反應，特異性達99.2%。

（三）流行病學溯源效能

1、臨床樣本檢測：126份血液樣本中人蒼白桿菌檢出率17.46%（22/126），89份糞便樣本中BRV、BCoV、K99聯合檢出率24.72%（22/89），與測序結果一致性達98.3%；

2、環境樣本溯源：從農貿市場樣本中檢出2株BCoV陽性，基因型與同期臨床病例分離株同源性99.5%，明確環境傳播途徑；

3、聚集性疫情追蹤：通過32份密切接觸者樣本的基因分型與病毒載量監測，成功構建3條傳播鏈，識別出2名隱性感染者為傳播源頭，為防控措施調整提供依據。

三、討論

流行病學溯源的核心需求是快速明確病原體“來源-傳播-變異”鏈條，熒光定量PCR技術作為分子溯源的關鍵工具，其檢測性能直接影響防控效率。博清生物熒光定量PCR儀通過以下技術優勢適配公共衛生應急需求：

（一）多場景適配性：96孔高通道型號滿足大規模篩查需求，8孔/16孔便攜式型號適配現場應急檢測，解決傳統儀器“實驗室局限”問題，實現“臨床-環境-密切接觸者”全鏈條樣本同步檢測；

（二）高精準檢測能力：六通道無干擾設計支持多重病原體同時檢測，結合自主研發的“實時動態精準溫控技術”，顯著提升低載量樣本檢出率，為隱性感染溯源提供技術支撐；

（三）溯源效率提升：相較于傳統單重PCR，該儀器檢測時間縮短40%以上，配套軟件可直接輸出基因型分析與系統發育樹數據，減少溯源分析周期，助力疫情快速處置。

本研究驗證了該儀器在細菌、病毒類病原體溯源中的應用價值，與相關研究結果一致。在聚集性疫情中，通過病毒載量動態監測與基因分型結合，可精準識別傳播源頭與風險人群，彌補傳統流行病學調查“時空模糊”的缺陷。此外，儀器兼容多種核酸提取試劑盒，降低基層實驗室應用門檻，具備規模化推廣潛力。

局限性方面，本研究樣本量集中于特定地區，不同病原體的溯源效能需進一步擴大樣本驗證；未來可結合數字PCR、二代測序技術，構建“快速篩查-精準溯源-變異監測”一體化平臺，提升新發突發傳染病防控的前瞻性。

博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀憑借高靈敏度、多通道兼容及場景適配性優勢，在病原體檢測、基因分型及傳播鏈追溯中表現優異，可有效支撐公共衛生應急響應與疫情流行病學溯源工作。該儀器的推廣應用有助于提升基層實驗室溯源能力，為疫情防控“早發現、早處置”提供關鍵技術保障，具有重要的公共衛生價值。